Jacques Gamblin naît le 16 novembre 1957 à Granville dans la Manche. Au départ, il ne se destine pas au métier de comédien mais il finit par attraper le virus en exerçant son métier de technicien au sein d'une compagnie théâtrale. Après avoir étudié à la Comédie de Caen, il débute sur les planches des théâtres de Bretagne. Il monte alors à Paris et décroche son premier rôle au cinéma en 1985 dans Train d'enfer de Roger Hanin. Trois ans après, on le voit dans Périgord noir puis dans des petits rôles chez Lelouch (La belle histoire, notamment), ou encore Guédiguian (A la vie, à la mort) en 1994. Gamblin connaît finalement le succès en 1996 grâce à son rôle d'homme d'affaires homosexuel dans la comédie à succès Pédale douce. Son interprétation lui vaut une nomination au César du meilleur second rôle masculin.

Loin de se laisser enfermer dans un registre unique, cet acteur discret et élégant enchaîne les tournages dans des films comme Au cœur du mensonge (Claude Chabrol) ou Les enfants du marais (Jean Becker). En 2002, Bertrand Tavernier lui offre le rôle principal de Laissez-passer. Ce rôle lui vaut le Prix d'interprétation masculine à la Berlinale. Une consécration méritée pour ce comédien discret et élégant qui poursuit ensuite sa carrière avec éclectisme. De Carnages à 25° en hiver en passant par A la petite semaine ou Holy Lola, Gamblin alterne les productions les plus diverses. A noter également, son excellente prestation en père de famille en 2008 dans le très attachant Le premier jour du reste de ta vie. Le comédien sait aussi choisir des rôles plus légers, à l'instar du Nom des gens, dans lequel il incarne à merveille un Monsieur Tout-le-Monde sympathisant de Lionel Jospin ! En 2012, on le retrouve en flic ténébreux dans le thriller A l'aveugle de Xavier Palud.