Justin Chambers voit le jour le 11 juillet 1970 à Springfield (Ohio, USA), issu d'une famille d'origines irlandaise et allemande de cinq enfants, dont un frère jumeau. Il se retrouve devant les projecteurs d'abord par le biais du mannequinat, en devenant notamment l'un des modèles de Calvin Klein et Girgio Armani.
En 1995, Justin Chambers fait ses débuts en tant qu'acteur dans la série
Another World. Il apparaît par la suite dans plusieurs productions destinées au petit écran, qu'ils s'agissent de séries ou de téléfilms. Le cinéma lui offre des rôles à partir des années 2000, à l'instar de
The Wedding Planner d'Adam Shankman (2001), avec Jennifer Lopez et Matthew McConaughey, et il joue même le rôle titre du
D'Artagnan de Peter Hyams (2001), aux côtés de Catherine Deneuve et Mena Suvari.
Il n'oublie pas ses premières amours en décrochant un rôle récurrent dans la série à succès
Cold Case (2003), mais c'est une autre série TV qui lui permet d'accéder à la célébrité. Justin Chambers intègre le casting de
Grey's Anatomy dès les premiers épisodes du show médical, incarnant le coureur de jupons Alex Karev.
L'acteur est marié à la même femme, Keisha, depuis 1993. Ils ont cinq enfants.