Nathan Fillion est né le 27 mars 1971 à Edmonton (Canada) de parents enseignants. D'abord désireux de suivre les traces de ses géniteurs en devenant professeur d'art dramatique, il s'oriente finalement vers une carrière d'acteur après avoir obtenu un rôle dans le feuilleton américain
One Life to Live (
On ne vit qu'une fois).
En 1997, il auditionne pour le rôle d'Angel dans la série
Buffy contre les vampires mais ne l'obtient pas. Il retrouvera pourtant le créateur de la série, Joss Whedon, par la suite. L'acteur enchaîne les apparitions mineures. On l'aperçoit ainsi dans les films
Il faut sauver le soldat Ryan de Steven Spielberg (1998),
Dracula 2001 de Patrick Lussier (2000) ou dans la série
Au-delà du réel : l'aventure continue.
En 2002, le showrunner Joss Whedon (
Buffy contre les vampires), change à jamais la carrière de Nathan Fillion. Il lui offre le rôle principal de sa nouvelle série, intitulée
Firefly, rapidement annulée mais ayant le temps de se constituer une solide base de fans. L'acteur reprendra le personnage du capitaine Mal trois ans plus tard dans l'adaptation ciné de la série,
Serenity.
Joss Whedon utilise également le talent du comédien dans sa série phare,
Buffy contre les vampires, lui octroyant le rôle de Caleb au cours de la septième et ultime saison du show.
Nathan Fillion est désormais clairement identifié comme acteur de séries TV, même s'il apparaît encore au cinéma dans
Horribilis de James Gunn (2006). Il collabore en 2007 avec un autre grand nom des séries TV, le showrunner Tm Minear, mais
Drive ne fait pas long feu.
L'acteur exerce alors ses talents dans des séries à succès telles que
Lost (2006) et
Desperate Housewives (2007). Il participe également activement à la web-série
Dr. Horrible's Sing-Along Blog (2008), aux côtés de Neil Patrick Harris. Au scénario, on retrouve un certain Joss Whedon.
Nathan Fillion retrouve véritablement le devant de la scène en 2009 avec la série
Castle, dont il interprète le rôle titre.