Né le 22 juillet 1955 dans l'Etat américain du Wisconsin, Willem Dafoe débute sa carrière de comédien par le théâtre expérimental, dès l'âge de vingt ans. Il décroche son premier rôle au cinéma en 1980 dans La porte du Paradis de Michael Cimino avant d'enchaîner les rôles troubles et ambigus. Son physique particulier fait ainsi merveille dans plusieurs seconds-rôles : on retiendra son rôle de vampire dans Les prédateurs de Tony Scott ou encore celui de faux monnayeur dans l'excellent Police fédérale Los Angeles de William Friedkin.
En 1986, il incarne un sergent dans l'inoubliable Platoon d'Oliver Stone qui lui permet d'obtenir une nomination à l'Oscar du meilleur second rôle. La fin des années 1980 est d'ailleurs toujours aussi consistante pour Dafoe qui enchaîne les rôles pour des réalisateurs aussi prestigieux qu'Alan Parker, Oliver Stone (pour la seconde fois) ou Martin Scorsese. On le voit ainsi en agent du FBI dans Mississipi Burning, en vétéran du Vietnam dans Né un 4 juillet et carrément en Jésus Christ dans La dernière tentation du Christ.

Dans la décennie suivante, Willem Dafoe poursuit sa carrière d'acteur à un rythme assez effréné. Après avoir joué aux côtés de Madonna dans Body, il continue de tourner pour d'autres grands noms de la mise en scène, que ce soit pour David Lynch dans Sailor et Lula, David Cronenberg dans ExistenZ, Abel Ferrara dans New Rose Hotel, ou Anthony Minghella dans le multi oscarisé Le patient anglais.
En 2000 son interprétation de Max Shreck (l'acteur qui joua Nosferatu dans le film de Murnau) dans L'ombre du vampire lui vaut une seconde nomination à l'Oscar du meilleur second rôle. Il se fait ensuite connaître d'un public plus jeune et encore plus large pour son incarnation du Bouffon vert dans la très populaire trilogie Spider-Man de Sam Raimi. On le découvre au cours de cette dernière décennie dans des films aux genres toujours aussi variés, alternant œuvres exigeantes (Manderlay et Dogville de Lars von Trier), comédies d'auteur (La vie aquatique) ou biopic (Aviator).
Après un détour par la comédie avec Les vacances de Mr. Bean, il retrouve en 2009 Lars von Trier pour Antichrist et, après Le monde de Nemo, s'adonne à nouveau au doublage dans Fantastic Mr. Fox. En 2012, il prête son corps et sa voix au Martien Tars Tarkas dans John Carter.