William Louis Petersen naît le 21 février 1953 à Evanston (Illinois, USA). Il a des origines danoise par son père et allemande du côté de sa mère. Excellent joueur de football US, il étudie à l'université de l'Idaho et obtient une bourse pour jouer dans son équipe de foot. Mais sa découverte du théâtre le détourne du sport. Il s'installe à Chicago et intègre la troupe de la Steppenwolf Theatre Company.
Il effectue ses débuts au cinéma en 1981 dans le film Le Solitaire, première réalisation pour le cinéma d'un jeune réalisateur nommé Michael Mann. L'acteur a le nez creux dans ses choix de carrière puisque sa deuxième expérience sur grand écran n'est autre que Police fédérale Los Angeles, de William Friedkin (1985).
En 1986, une vieille connaissance, Michael Mann, se souvient de lui pour son nouveau long-métrage, Le Sixième sens, offrant à William Petersen le rôle principal d'un film marquant, première apparition du personnage d'Hannibal Lecter à l'écran, cinq ans avant Le Silence des agneaux de Jonathan Demme.
L'acteur continue de fréquenter des cinéastes qui comptent, ou en devenir, en tournant sous la direction de Mike Newell dans La Force du silence (1987) et Joel Schumacher dans Cousins (1989). Le petit écran lui apporte un rôle dans la série culte Retour à Lonesome Dove en 1993, mais les années 90 s'avèrent moins inspirées pour l'acteur. Tout juste note-t-on sa participation à Fear, de James Foley (1996) pour son rôle le plus important de cette période.
Le nouveau siècle arrive donc à point nommé pour William Petersen, qui décroche le rôle du leader de l'équipe des Experts, une nouvelle série lancée en 2000. Le personnage de Gil Grissom permet au comédien de retrouver le haut de l'affiche, Les Experts connaissant un succès incroyable, au point de donner naissance à deux séries dérivées (Les Experts : Miami et Les Experts : Manhattan).
William Petersen parle couramment espagnol après un séjour passé à Bilbao avec un ancien professeur d'art dramatique. Il a une fille d'un premier mariage et vit aujourd'hui avec sa compagne Gina Cirone. Ils se sont mariés en Italie.